在真核多细胞生物体中，细胞数目通过细胞分裂、增殖与细胞死亡维持基本恒定。此种增殖与死亡的平衡对生物体的发展与保持正常结构与功能有重要意义。细胞死亡分被动性或意外(accidental)死亡，即坏死，及主动程序性死亡，即凋亡。目前已有大量资料表明凋亡是细胞生命的基本特征。凋亡过程调节机体的发育、进化，维持内环境的相对稳定。异常细胞凋亡参与多种病理生理异常如肿瘤、自身免疫疾病、神经系统疾病及炎症的发病机制。关于细胞凋亡的研究已成为近年最引人注目的课题，相关资料极为丰富，研究手段亦日臻完善。但在心血管系统领域内，细胞凋亡的研究受到一系列因素的制约。①心肌细胞，如同神经细胞，属于终末分化的细胞，一般认为终其一生此类细胞数目保持恒定，并不发生有丝分裂，因此生理及病理状态下心肌细胞是否发生凋亡。以及凋亡是否有调节心肌细胞数目的作用，尚有争议。近年来越来越多的证据表明心肌细胞可以发生凋亡，既可在体内，亦可在体外培养条件下；既在心脏胚胎发育阶段影响心脏的形成与功能发育，与数种遗传性或先天性心脏疾病有关，且参与成年心肌细胞的衰老过程。②由于标本采集及方法学的限制，要确定心肌细胞是否发生凋亡，以及凋亡的范围、速率、时相及调节机制，较其他领域有更大的难度。目前关于细胞凋亡的实验室检测手段主要是从细胞凋亡的形态学和生化改变对其进行体外的定性与定量分析。形态学方法包括直接用显微镜(光镜或电镜)或流式细胞仪检测，细胞凋亡有典型的形态学特征，但需依赖于同时观察到一系列形态学特征才能作出准确的判断。若以形态学方法作定量分析则偏差较大。检测细胞凋亡另一直观的，也是目前应用最为普遍的方法，即观察细胞染色体DNA的变化。

一、细胞凋亡与动脉粥样硬化 (AS)

　　　近年，有关平滑肌细胞(smooth muscle cell，SMC)凋亡的报道不断增多。Leppert等证实，子宫平滑肌细胞程序性死亡参与子宫颈的成熟过程。他们在研究中发现，在妊娠12天到21天之间，随着妊娠大鼠子宫颈的逐渐软化，宫颈SMC死亡数量也随之增多。Santarosa等发现，增生肥大的家兔膀胱恢复到正常状态与SMC的凋亡有关；Fukasna等的研究表明，大量的细胞凋亡，可能是单发的早期肌纤维瘤自发性消除的机制之一。在小鼠出生后不久的生长期内，于其食管肌肉系统中发现胚胎时期的平滑肌转变成骨髓肌的现象发生，Patapoutian等认为这是程序性反向分化的结果。可见，细胞凋亡在平滑肌细胞的正常生长、分化和发病机制中可能具有重要作用。

　　AS发生时细胞凋亡异常活跃已为诸多研究所证实。Geng等检测AS冠状动脉和颈动脉，发现病变内膜中TUNEL阳性细胞数(34±6％)明显高于无病变的内膜(8±3％)，从AS斑块中可检出DNA降解片段(寡核苷酸)，而正常内膜为阴性。Isner等报道原发性AS病变中细胞凋亡检出率冠状动脉为29％，周围动脉为43％。凋亡细胞在AS纤维帽中富含脂质的核心内尤为明显，经常成串排列。用TUNEL技术结合细胞种类特异性标志免疫染色法证实，AS病变中凋亡的细胞多数为平滑肌细胞(SMC)与巨噬细胞，但中层SMC并不发生凋亡。在大鼠模型主动脉内皮剥脱后亦可观察到SMC凋亡之于表面新生内膜的差异性。

　　在AS病变形成过程中，特别是脂肪条纹向纤维脂肪性斑块演进时，无细胞的脂质核心的形成是关键步骤。该核心既往认为是由于来源于巨噬细胞的脂质泡沫细胞发生坏死所致。此类细胞发生坏死的机制尚未明确，据推测可能与缺氧或胞内细胞毒性脂质过氧化物释放有关。最近有证据表明巨噬细胞既可能发生坏死，亦可能发生凋亡，脂质核心周边有泡沫细胞坏死与凋亡，脂质核心内有凋亡细胞核残余物。某些TUNEL阳性细胞尚显示有增生核细胞抗原(PCNA)，提示AS发病中某些细胞的增殖和凋亡都较活跃，原发性AS病变中细胞数较少而凋亡小体较多，提示脂质核心的形成可能是细胞凋亡活性大于增殖活性的结果。新生AS斑块极为脆弱，易于发生破裂。此后胶原纤维合成与沉积加速。斑块内不同种类细胞的相对数量可能调节胶原合成的速率，决定斑块中纤维成分的比例，若富含脂质的泡沫细胞增加，则伴随有SMC的减少，而后者可以合成胶原。此外，细胞的数量亦可能由凋亡调节。若SMC过度凋亡则胶原合成分泌不足，可降低AS斑块的稳定性而导致急性临床事件(不稳定心绞痛、心肌梗塞)发生。迄今的资料虽已显示细胞凋亡可能参与AS斑块的形成过程，但在不同的阶段和不同的细胞其表现形式尚未充分研究，与斑块形成过程的病理改变之间亦尚未找到令人信服的联系，因此尚不足以推翻传统的AS斑块形成的理论，但可从新的方向上进一步补充、完善原有的理论。

　　AS病变时细胞凋亡的发生与调控机制尚未充分阐明。c-myc基因表达失调可能是 SMC增殖和凋亡的主要因素之一。AS斑块中SMC的c-myc基因表达增高而Bcl-2基因表达下降。另一调控因子为白细胞介素-1β转化酶(ICE)。用RT-PCR技术证实 TUNEL阴性的SMC和巨噬细胞表达ICEmRNA，提示ICE表达增强可能诱导凋亡。内皮生长因子(IGF)与血小板衍化生长因子(PDGF)对于SMC存活甚为重要，若此类因子缺乏可导致SMC凋亡。Bennet等发现，正常人的冠状动脉与主动脉SMC仅在去除血清生长因子后才发生凋亡，而AS斑块中的SMC即使在高水平血清环境中亦发生凋亡，若去除血清则凋亡加剧，表明血清生长因子缺乏只是AS斑块中SMC凋亡的部分原因。SMC的凋亡亦与野生型或突变性p53基因有关。SMC在过度表达c-myc的环境中发生p53依赖的凋亡。从人AS斑块中分离出来的SMC，其自发的，或过度p53表达所诱导的凋亡，均较正常血管SMC为高。细胞凋亡的另一类重要的调控机制为死亡受体依赖途径，最引人瞩目的是Fas。AS病变中的细胞，特别SMC，广泛表达Fas抗原，而20％Fas阳性的细胞有凋亡的形态学表现。IFN-γ，IL-1和TNF-α均可单独诱导凋亡，若以这些因子处理SMC，则Fas阳性细胞可增至90％，单个细胞Fas的密度亦加大。此类因子诱导凋亡既可以一氧化氮(NO)依赖方式，亦可以非依赖方式。这些因子参与AS凋亡的现象亦提示局部炎性细胞与AS发生有关，如浸润的活化T细胞可分泌IFN-γ，巨噬细胞可分泌IL-1和TNF-α。最近有研究揭示氧化机制在血管细胞凋亡中的意义。培养中的血管内皮细胞为氧化型低密度脂蛋白(LDL)诱导而发生凋亡，细胞对LDL的敏感性为NO或钙通道阻滞剂所降低。此外，超氧化物所致损伤亦可能与SMC凋亡有关。氧化型LDL在体外能诱导巨噬细胞发生凋亡，可能是AS病变中早期泡沫细胞死亡的原因之一。凋亡细胞表面的磷酰化丝氨酸可在体外促进血栓形成，该发现颇有趣味，至于是否与体内AS病变的血栓形成有关，尚值得进一步研究。

　　原发性AS病变中并非总能检出细胞凋亡，而血管成形术后再狭窄(RS)则几乎均发现细胞凋亡，如有人测出RS病变中冠状动脉凋亡率为86％，周围动脉为93％。大鼠主动脉去内皮15天后，病灶中发现大量的凋亡SMC，在20天达到顶峰，到45天损伤处内皮重新愈合后，凋亡的SMC基本消失。另一项大鼠球囊扩张所致血管损伤的研究发现，凋亡主要在扩张后7～28天累及新生内膜SMC。但Perlman发现大鼠球囊扩张后仅0.5～2小时，中层SMC即有70％呈TUNEL阳性。两种SMC凋亡的时相差异提示血管内皮损伤诱导中层SMC的凋亡，而新生内膜SMC的凋亡与损伤后RS有关。 RS病变中细胞数较多，而凋亡小体较少，病变中凋亡小体密度与内膜细胞数显著负相关，从而提示SMC凋亡是调节内皮损伤所致内膜增厚过程的重要机制。细胞增殖和凋亡的动态平衡是维持细胞数稳定的主要因素，此种平衡的丧失是RS发生的重要机制。新生内膜的SMC其c-myc基因上调，RS部位p53过度表达，提示c-myc上调表达可能激活p53，然后通过p53依赖途径诱导凋亡。综上所述。可见RS时既有细胞的过度增殖。亦有细胞凋亡活跃，如何解释此矛盾现象及其在RS发生中的作用，尚需积累更多研究资料。

　　至于细胞凋亡在动脉粥样硬化中的作用，研究已表明在没有侵占血管腔的前提下，动脉粥样硬化的病变能稳定性地加重，这是由于血管产生松弛的缘故。血管松弛也常被称为血管重塑即指血管壁的结构组织和细胞构成发生重分布的过程。一个显而易见的可能机制是：这种血管重塑取决于血管壁各处细胞增殖与细胞死亡之间相互作用的协调性。最近的一篇有关新生羊羔血管重塑的报道是这一机制的直接证据。出生后小羊羔血管腔口径持续性发生变化，这种变化用血管壁DNA含量的多少作为指标来判定。Cho等发现血管腔口径的变化与细胞凋亡的发生率有关，即细胞凋亡的发生率高则血管腔口径大，反之细胞凋亡的发生率低则血管腔口径小，而受细胞增殖的影响较小。在人类的动脉粥样硬化病灶和大鼠动脉损伤模型的新内膜中均可找到凋亡细胞，绝大多数凋亡小体均被邻近的巨噬细胞和SMC吞噬。可见，凋亡的程度和凋亡小体的吞噬在动脉粥样硬化的发病机制中起一定的作用。邻近的正常细胞对凋亡细胞的吞噬是迅速的和特异的，SMC能识别暴露在多种类型细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸；细胞发生凋亡时，常伴有其胞膜表面磷脂酰丝氨酸的明显增加。Bennett等证实SMC在发生凋亡过程中磷脂酰丝氨酸合成增加，邻近的正常SMC与凋亡细胞的结合和对凋亡细胞的吞噬作用可能部分与此有关。这种机制在促进血管壁内细胞的快速消除中可能有重要意义。

　　Isner等发现，细胞凋亡的发生在血管再狭窄病例的血管中要比早期动脉粥样硬化病例的血管中更为常见。大鼠主动脉去内皮后可引起中膜SMC的迁移和增殖，形成新内膜，造成内膜增厚。当内皮重新愈合后，增厚内膜的细胞即明显减少。Bochaton等在大鼠主动脉的实验中发现。去内皮损伤15天后，病灶中可发现大量凋亡的SMC；凋亡的SMC数量于损伤后20天达最多；45天后，当损伤的内皮重新愈合时，凋亡的SMC亦随之消失。他们认为SMC的凋亡是调节内膜厚度演变的重要机制之一。冠状动脉搭桥术后的主要问题是隐静脉移植片的闭塞，Kockx等对此类闭塞的隐静脉移植片进行研究，发现81％的闭塞源于肌内膜增厚、吞噬有血小板的泡沫细胞在血管腔内的堆积和血栓形成。增厚肌内膜的主要组成成分之一是位于纤维组织基质的SMC，位于隆凸基底层附近的SMC具有凋亡细胞亚显微结构的特征。

　　研究结果均表明，细胞凋亡参与了损伤病灶区内细胞构成的调节，细胞凋亡在动脉粥样硬化的发生、演化过程中可能起着独特的调节作用。

二、细胞凋亡与急性心肌梗塞 (AMI)和缺血-再灌注损伤(IRI)

　　既往认为AMI时主要表现为心肌细胞由于缺血缺氧，能量代谢衰竭而引起急性细胞死亡(坏死)。近来有证据表明AMI时既有坏死，也有凋亡发生。AMI尸检标本中，可见凋亡的心肌细胞主要位于梗死中心区域与末受累区域之间的低灌流带，即环绕心梗损伤的部位，这一区域的心肌细胞其DNA降解、染色质浓缩、细胞皱缩等凋亡特征均较明显，且上调表达凋亡调节蛋白Bel-2和Bax。动物实验证实甚至心梗中心部位的心肌细胞亦有5％～33％的DNA片段阳性染色。Bardales等用TUNEL技术检测80例心脏组织切片发现常规苏木素和伊红染色的病理学组织学检查尚不能发现典型改变时，TUNEL即已检出心肌细胞缺血性死亡。大鼠冠状动脉阻断后3小时梗塞周边区即可检出凋亡细胞，直至一个月后仍可检出。另一项动力学研究发现，冠状动脉阻断后1～2天梗塞区凋亡细胞发生达高峰，以后逐渐降低，14天后维持在一个相对稳定的水平，而远离梗塞区的心肌细胞其凋亡率很低，与正常时相似。

　　目前还不清楚细胞凋亡与坏死在AMI中的相对重要性及彼此关系，在心梗周边低灌注区域及中心部位的早期检出凋亡细胞，提示一种可能性，即轻度的缺血可引起凋亡，随着缺血的加重，特别是有炎性反应参与时，中心部位从以凋亡为主过渡到以坏死为主，坏死细胞内容物释放触发炎性反应又使坏死区域进一步扩大。从凋亡到坏死的过渡，核形态的改变亦从固缩向溶解转型。既然在早期轻度缺血阶段以细胞凋亡为主，则有可能在此阶段人为地抑制凋亡而阻断梗塞的扩大化，如有人用凋亡关键酶caspase抑制剂ZVAD.fmk治疗AMI，可使梗塞范围减小，心功能指数改善。至于AMI慢性期凋亡发生的状况和意义，以及凋亡抑制物有无治疗价值，目前尚缺乏确切的依据。

　　已充分证明再灌注损伤(IRI)是AMI发生、进展的重要机制。心肌缺血-再灌注损伤中细胞凋亡的参与，正在受到关注。以往认为分化成熟的细胞，如心肌细胞和神经元细胞不发生凋亡；但近期研究已证明心肌病、心律失常、心力衰竭、猝死和冠状动脉等许多心血管疾病的发生发展与细胞凋亡现象的多寡有关；在心肌缺血-再灌注损伤中，细胞凋亡亦有着重要意义。

(一)细胞凋亡在心肌缺血-再灌注损伤中的证据

　　体内与体外的动物实验研究已发现心肌细胞凋亡与心肌缺血-再灌注损伤等心血管疾患有着密切关系。最初见于1994年Gottlieb等的报道，他们在家兔离体心脏灌注模型上发现，缺血30分钟后再灌注4小时组出现心肌细胞凋亡，心肌细胞呈现DNA梯状现象及核染色质浓缩，提示心肌细胞凋亡是再灌注心肌损伤的特征之一，并可能与自由基诱发有关。而后Fliss等采用原位末端标记(ISEL)及琼脂糖凝胶电泳技术也确定在缺血和缺血再灌注大鼠心肌细胞中有典型的凋亡形态改变与DNA梯形格局，认为缺血和缺血再灌注大鼠心肌均可发生细胞凋亡；心肌细胞凋亡与缺血和缺血再灌注持续时间的长短有关；心肌缺血再灌注过程可诱导心肌细胞凋亡，细胞凋亡是心肌再灌注损伤的特征之一，并可能与再灌注心肌迟发性死亡密切相关。对于心肌再灌注后如何帮助心肌细胞功能恢复的研究带来重要的启示。

　　Saraste等研究8例死于急性心肌梗塞的人体心肌标本，其中有6例患者接受过成功的溶栓疗法，2例病理检查显示出血性梗死，提示有自发性心内膜下缺血再灌注损伤；通过ISEL方法检测到典型的细胞凋亡生化特征，DNA断裂广泛形成，心肌细胞凋亡特别是在梗死心肌的周围区域，而其他远端无梗死的心肌很少有凋亡细胞；并认为除了坏死，在心肌缺血-再灌注损伤中还有细胞凋亡参与病变形成。

　　Sawa等应用脂质体转染人Bcl-2基因于大鼠的心肌细胞，发现此类大鼠在随后30分钟再灌注时左室舒张压恢复，CPK明显降低；而对照组大鼠心肌细胞出现DNA降解片段，表明Bcl-2可抑制心肌缺血-再灌注损伤时心肌细胞凋亡的发生。

　　Sharov等应用透射电镜和核DNA片段原位免疫组化标记法证实冠脉微栓塞犬的陈旧梗死周围心肌细胞野生型p53表达促使细胞凋亡；反之，远离梗死部位的心肌细胞凋亡过程更活跃，并认为细胞内钙聚增加、氧自由基形成和缺氧均可作为凋亡的激活因素。

　　以往研究的结果证实缺血预适应(Ischemic Preconditioning)可预防致死性细胞损伤，并且作为一种结果，限制心肌梗死面积扩大。为证实该假想：缺血预适应减少不可逆缺血性损伤的部分机制是通过减少细胞凋亡所起到作用的，Shirakawa等在大鼠实验性心肌缺血预适应模型中，发现预适应可降低TNF-a在缺血边缘区的表达，有可能阻止缺血细胞发生凋亡。Piot研究活体大鼠心肌缺血预适应模型，亦证实细胞凋亡与坏死同时存在于心肌缺血-再灌注损伤中；活体大鼠心肌梗死面积大小与缺血和再灌注后的心肌细胞DNA片段化和程度有关；并且认为，缺血预适应可以减少损伤面积和长时间缺血-再灌注后的心肌细胞DNA片段化现象，从而较大程度地减轻不可逆性心肌缺血、损伤。

　　针对心肌缺氧、缺血-再灌注损伤及心肌梗死后周边组织发生细胞凋亡现象，Kirshenbaum等研究心肌细胞凋亡的分子调节机制。结果证实p53基因为心肌细胞凋亡的激活因子，并且指导着凋亡促进基因Bax的转录；更重要的是，由p53激活的心肌细胞凋亡可以被抗凋亡基因Bel-2所阻断；Bcl-2甚至削弱了p53介导的Bax启动基因的转录；支持了Bel-2是一个强有力的抗凋亡因子。

　　Misao等研究了Bcl-2基因和Bax基因在人类心肌梗死心室肌细胞中的表达作用。37个对象包括急性心梗15例，陈旧性12例；正常对照10例。结果：在正常对照和陈旧心梗者的心肌细胞中无阳性Bcl-2免疫应答，而AMI中9例(60％)Bcl-2免疫应答阳性，位置在梗死组织周边区仅2例过度应答(13％)，而AMI中则为10例(83％)。认为Bcl的表达和Bax过度表达在心肌缺血和/或再灌注后心肌细胞凋亡的保护或促进可能起相当重要的病理生理作用。

　　研究表明，凋亡参与心肌缺血-再灌注损伤病灶内细胞构成的调节，细胞凋亡在再灌注损伤发生、演化过程中可能起着独特的调节作用。

(二)细胞凋亡在心肌缺血-再灌注损伤中的意义

　　冠状动脉再通术，包括药物溶栓疗法、血管成形术和血管搭桥术等，已成为目前治疗冠心病急性心肌梗死行之有效的方法。对缺血心肌的早期再灌注治疗肯定有益，可使缺血损伤的心肌存活，缩小梗死的面积；但若在冠状动脉堵塞较长时间后得到再灌注则有一定程度的再灌注损伤；资料显示，在梗死后4小时或更晚时行再灌注有时适得其反，反而可促进细胞的死亡。因此对于改善血流以治疗心肌缺血，同时采取细胞保护措施防治心肌缺血-再灌注损伤，促进心肌细胞存活具有重要意义。

　　要做到更好地防治心肌缺血-再灌注损伤，一个重要前提就是了解清楚其发现机制。关于再灌注心肌损伤的机制，曾有过许多假设和报道，但新的事实有时把原来的假设否定了。目前多倾向三方面因素：一是再灌注导致细胞内钙离子超载；二是氧自由基大量产生；三是微血管损伤和白细胞的作用。然而确切的作用机制并未完全阐明。近年来，对细胞凋亡在缺血-再灌注损伤中的研究已为探索其本质以及寻求生物学防治方法提供了新的思路。研究资料表明，心肌缺血-再灌注损伤中存在着凋亡机制，且与细胞内钙超负荷、氧自由基生成等因素有关；至于其因果关系以及如何通过减轻心肌细胞凋亡而起到防治再灌注损伤中的作用，尚需进一步研究。

　　许多学者研究注意到反复短暂缺血后，心肌发生自我保护现象，即所谓缺血预适应，可减轻心肌缺血-再灌注损伤程度，表现在缩小梗死面积、促进心肌功能恢复、保护心肌超微结构和减少再灌注心律失常等。通过对活体的动物实验研究已显示出，缺血预适应能缩小梗死面积、减轻不可逆性缺血损伤，与减小了心肌细胞凋亡有很大关系。更进一步支持细胞凋亡与心肌缺血-损伤之间内存联系，亦支持缺血预适应是一项有效的心肌保护措施的观点。Gottlieb通过研究缺血预适应对家兔心肌细胞中的pH值、 ATP酶和细胞凋亡的影响，认为预适应是通过蛋白激酶C(PKC)的信号传递来保护心肌细胞的，而PKC介导预适应可使得在代谢抑制中激活ATP酶，从而稀释了细胞间酸化产物，减缓了细胞凋亡的发生。因此在心肌缺血-再灌注损伤中，细胞凋亡是可能预防的。

　　最近，Vakeva等观察实验大鼠心肌再灌注损伤中激活的终末补体成分对细胞凋亡和坏死的作用，并应用单克隆抗体C5治疗，结果见抑制补体活性的治疗组与无抑制补体活性的对照组比较，梗死面积缩小以及凋亡现象显著减少；并且认为终末补体成分 C5a和C5b-9是急性心肌梗死和再灌注损伤中组织损伤的重要介质。

　　总之。心肌细胞凋亡是心肌缺血-再灌注损伤病变中的主要形式之一。明确该事实，对临床治疗和预防再灌注损伤中，寻求如何保护心肌的措施开拓了新的思路。