【摘要】目的 对中国人WD基因8号外显子进行突变分析。方法 对中国人Wisons病45例患者以及20例正常人的ATP7B基因8号外显子进行SSCP分析，对有异常者进行测序，根据突变点序列设计合适的内切酶对所有患者进行酶切分析。结果 正常组未见异常。患者组发现exon8有泳动异常，序列分析证实G2273T置换，即Arg778Leu突变。用限制性内切酶MspⅠ对45例患者以及20例正常对照进行该位点酶切分析，表明正常组未见异常，患者组有2例突变纯合子，占患者总数4.4%，11例杂合子，占12.2%。外显子8的Arg778Leu突变率占WD突变基因的16.67%。检测了2个突变家系。结论 8号外显子突变可能是

   中国人WD发病的较重要原因。

    Studyonmutationofexon8ofWisonsdiseasegene

    XUPingyi，LIANGXiuing，MAShaohun

    DepartmentofNeuroogy，FirstAffiiatedHospita，

    SunYat-senUniversityofMediaSienes，Guangzhou，510080P.R.China 

    AbstratObjetiveToanayzethefrequenyofmutationinexon8ofWisonsdiseasegeneinChinesepeope.MethodsSreeningforATP7Bgenemutationwasondutedin45WDpatients.Mobiityshiftofexon8wasanayzedbySSCP.Nueotidesequeneofexon8wasanayzed，andthePCRprodutswereutbyenzymeMspⅠ.

    TheauthorsfoundG2273Tmutationatodon778，andaordingtothismutationsequene，madeananaysisofenzymeutbyMspⅠinapatients.2WDfamiieswereanayzed.ResutsNoabnormaitywasfoundin20ontros.In45patients，2werehomozygousThepositiverateofmutationwas16.67%.TheArg778Leumutationwasvaidatedbythisstudy.ConusionThemutationinexon8ofWDgenemaypayanimportantroeinpathogenesisofWisonsdiseaseinChinese.
    KeywordsWisonsdiseaseGenemutationNueotidesequeneanaysis

    肝豆状核变性又称Wisons病，是一种常染色体隐性遗传性疾病，以铜代谢障碍为特征，主要表现为肝和神经系统病变。该病基因定位于13q14.3区^［1］，基因含有21个外显子，编码1411个氨基酸。其蛋白产物为一铜转运ATP酶。自1993年起多位学者对其基因突变位点等进行了深入的研究^［2-4］，目前已有将近95种突变类型被发现^［5，6］，但对中国人的WD基因突变类型和高频突变点的道甚少。为了探讨中国人WD患者的突变特点，我们对45个WD患者进行PCR-SSCP分析，异常泳动者进行DNA测序，并设计了基因突变点的酶切检测，其结果告如下。

    1 材料与方法

    1.1DNA标本收集收集20例无亲缘关系正常个体及45名来自全国各地已确诊为WD患者及2个WD完整家系成员外周抗凝全血10m，经酚-氯仿抽提法提取白细胞DNA。正常个体标本由中山医科大学附一院血库提供。WD患者经本科确诊，具有典型锥体外系症状和体征，角膜K-F环阳性以及血清铜蓝蛋白水平低下，24小时尿铜含量升高等生化特征。

    1.2基因突变筛查的PCR-SSCP法8号外显子扩增设计参照文献［5］。25μPCR反应体系中，含1μDNA样品，20pmo引物，1×PCR缓冲液，0.2mmodNTP，1UTaq酶；97℃变性10分钟后，94℃30秒，退火50秒，72℃每分钟循环35次，最后72℃延伸10分钟，扩增产物经1%普通琼酯糖电泳鉴定后，按文献［7］方法稍作改良进行SSCP分析。PCR产物8μ加8μ甲酰胺变性剂，97℃变性5分钟，-20℃立即上样至6%或8%的聚丙酰凝胶中，以0.5×TEB为电泳缓冲液，4℃200V电泳4～5小时，取胶后用银染法［8］观察结果。

    1.3PCR双链模板的直接测序按参考文献［9］进行。25～50μPCR产物经透析袋法纯化后，用超纯水溶解后测浓度。将此双链模板与测序引物以1∶20浓度混合，按美国USB公司的SequenaseVer.2测序盒说明和北京亚辉生物医学工程公司的α-32P-dATP37TBq/L进行标记和延伸反应。以每孔3.5μ上样于含7mo/L尿素的6%聚丙烯酰胺变性凝胶中1200V电泳4小时，放射性自显影12～24小时。

    1.4PCR产物酶切检测PCR产物4μ加入20μMspⅠ，12μ反应体积，37℃酶切6～8小时。酶切后产物经8%的非变性丙烯酰胺进行电泳，缓冲液0.5×TBE。Marker采用pGEM-7ZF/HaeⅢ标记。25℃100V电泳2小时。电泳后EB染色2分钟，紫外透射灯下观察结果。

    2 结果

    2.1PCR-SSCP结果在对45例患者和20例正常对照的8号外显子进行SSCP筛选时，正常对照组均未见异常，患者组有3个泳动异常，家系分析发现有两个为多态现象，另一例家系分析表明，患者的祖母、外祖父、外祖母、母亲、妹妹均显示正常，患者的单链位置明显与家人不同，而患者的父亲、祖父则出现4条带，其中两条与正常的位置表现相同，另外两条则与患者的两条位置相同。

    2.2基因突变的序列分析将上述异常表现的患者和其父亲及1例正常人的exon8PCR产物纯化后测序，两次独立进行的实验结果并与Genebank中的ATP7B基因序列对比发现，患者在WD基因8号外显子778密码2273位点发现纯合的G→T突变，是CGG变成CTG，使之编码的亲水的Arg被疏水的Leu置换，引起该基因表达产物的变化，很可能引起功能缺失。其父亲的序列分析发现在2273位点存在杂合状态，G及T碱基同时存在同一位置。

    2.3酶切结果见图1。由于8号外显子突变点778密码子CGG→CTG，MspⅠ酶切位点消失，故正常标本酶切片段为256bp、30bp两个片段，而在患者中，发现2例纯合子，酶切时因发生突变而导致酶切位点消失，故其PCR产物没有发生变化，占患者总数4.4%。发现11例杂合子，酶切后出现两条片段约为296bp和256bp，两条的颜色深浅相近，占患者总数12.2%。检出阳性率占患者总数16.7%。其余患者均表现为酶切完全，个别在原PCR产物位置也有一条颜色极浅的带，可能是酶切不完全所致。在20例正常人对照组中，均见安全酶切的256bp和30bp两个片段，即表明无异常。


    图1WD基因exon8PCR-MspⅠ酶切分析M：酶切电泳带，1：纯合子，2 ：杂合子，3：正常对照

    Fig1Theanaysisofexon8PCRprodutofWisonsdiseasegenedigestedbyMspⅠ.M：Marker，1：Homozygous，2：Heterozygous，3：Normaontro

    2.4家系分析见图2。本研究中2个家系资料比较完整，酶切结果发现：家系1，患者男性，纯合子，祖父及父亲为杂合子，母亲及妹妹为正常。家系2，患者女性，纯合子，父母及姐、妹均为杂合子，其夫及子为正常。


    图2 WD基因exon8PCR-MspⅠ2个家系分析箭头所示为先证者

    3 讨论

    3.1Wisons病基因的高频突变点1995年Thomas^［5］道在欧洲人中exon14突变率为28%，主要发生His1070Gn突变，exon18突变率为10%，主要发生Gy1367Lys突变，其余各外显子的突变频率均在1%～2%。我们通过对45例患者WD基因8号外显子扩增产物进行酶切检测，发现13例存在异常，酶切阳性率为16.7%，DNA测序证实为8号外显子2273位点G→T错义突变，导致778号密码子Arg778Leu突变。其结果与Thomas^［5］、Lee-MingChung［10］等检测的结果一致，与欧洲人明显不同。

    另外，我们研究发现45名WD患者WD基因8号外显子扩增产物经MspⅠ酶切后，纯合子占患者总数的4.4%，杂合子11例占患者总数的12.2%，检出阳性率占患者总数28.8%。在20例正常人中却无一例异常，表明778密码子的酶切异常不是一个多态性表现，而是一个病理性改变。可以认为，WD基因8号外显子778密码子错义突变可能为中国人Wisons病基因突变的一种方式。

    3.2Arg778Leu改变与疾病的关系已有的研究表明，WD患者基因突变一般涉及的是ATP酶切功能区，而不是金属离子结合区^［3］。在欧洲患者中，exon14突变率最高，而该外显子在ATP7B基因中处于磷酸化区和ATP结合区^［2-4］。本研究结果提示exon8突变频率为16.7%，

    在中国患者中频率较高，而exon8在整个ATP7B基因中处于跨膜功能区^［2-4］，该位点发生突变，可能导致该蛋白质的一级、二级结构发生改变，使其功能丧失，导致铜转运在细胞膜上的停滞，最终导致患者致病。国内其他学者的研究以及我们的研究中发现在中国患者exon14无异常，提示中国患者和欧洲患者在发病的分子遗传学基础上有差异，但临床方面的差异尚无肯定的研究道。

    3.3PCR-MspⅠ酶切家系分析目前，Wisons病的诊断依据临床症状、体征及铜生化检测结果，对早期诊断尤其是症状前诊断存在困难，而RFLP及微卫星DNA标记对WD基因进行间接连锁分析，其结果又存在局限性，因此，利用WD基因高频突变点对其进行PCR酶切分析则方便快速。我们对2个WD家系开展的PCR-MspⅠ分析，其结果是较准确地检出了2名异常纯合子、6名杂合子及4名正常人，诊断信息为100%。说明WD基因8号外显子高频突变点的发现，对开展中国人群中WD基因筛查具有较重要意义。

    本课题由国家自然科学基金和广东省自然科学基金资助

    参考文献

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